Application of fluorescence to structurally and functionally characterize conformational intermediates of pentameric ligand-gated ion channels
Applications de la fluorescence pour la caractérisation structurale et dynamique d'intermédiaires conformationnels des récepteurs-canaux pentamériques
Résumé
Pentameric ligand-gated ion channels (pLGICs) are membrane proteins found in both eukaryotes such as the glycine and serotonin receptors and in some prokaryotes like GLIC. In Humans, these receptors are involved in fast synaptic transmission and are a major therapeutic target for general anesthetics or anxiolytics and their mutation lead to severe diseases such as myasthenia, epilepsies or rare neurological diseases like hyperekplexia. Agonist binding on these receptors promote structural reorganizations leading to the active state with an open pore allowing ion flux. Structural and functional properties of these receptors have been studied and combined in this work to explore conformational dynamics of pLGICs. Several approaches have been used to: 1) determine pre-activation kinetics of GLIC at the hundreds of milliseconds timescale, 2) measure the effect of mutations deeply impacting global reorganizations highlighting the major role of allosteric coupling of different protein domains to permit its activation, 3) characterize intermediate states of eukaryotic pLGICs upstream activation. Combined to structural analysis, fluorescence data obtained provide detailed description of conformational intermediates of pLGICs activation and deepen the knowledge of molecular mechanisms determining normal and pathological functioning of these receptors.
Les récepteurs canaux pentamériques (RCPs) sont des protéines membranaires présentes à la fois chez les eucaryotes comme les récepteurs à la glycine GlyR, et à la sérotonine 5-HT3R et chez certains procaryotes comme GLIC. Chez l’Homme, ces récepteurs sont impliqués dans la transmission synaptique rapide, ils sont une cible thérapeutique importante par exemple pour les anesthésiques généraux ou les anxiolytiques, et leur mutation entraine des pathologies sévères telles que des myasthénies, des épilepsies ou des maladies neurologiques rares comme l’hyperekplexie. La liaison de l’agoniste sur ces récepteurs favorise des réorganisations structurales qui amènent à un état actif pour lequel le canal est ouvert et permet le passage d’ions. Les propriétés structurales et fonctionnelles de ces récepteurs ont été étudiées et combinées dans ce travail pour explorer la dynamique conformationnelle des RCPs. Plusieurs approches par fluorescence ont été utilisées pour : 1) déterminer la cinétique de pré-activation de GLIC qui se passe à l’échelle de la centaine de microsecondes, 2) mesurer l’effet de mutations sur GLIC qui impactent profondément les réorganisations globales ce qui démontre l’importance du couplage allostérique des différentes régions de la protéine pour permettre son activation, 3) caractériser des états intermédiaires des RCPs eucaryotes qui se trouvent en amont de l’activation. Combiné à l’analyse structurale, les données de fluorescence obtenues permettent de détailler des intermédiaires conformationnels de l’activation des RCPs et d’approfondir les connaissances sur les mécanismes moléculaires qui régissent le fonctionnement normal et pathologique de ces récepteurs.
Origine : Version validée par le jury (STAR)